DNA-EMSA技术服务信息

     凝胶滞留实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是研究DNA与蛋白质相互作用的经典方法。实验原理为利用标记（生物素或同位素）的DNA探针与细胞核提取物或纯化蛋白孵育，形成DNA-蛋白复合物后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。由于DNA-蛋白复合物的分子量和构象大于游离DNA探针，迁移速率降低，在凝胶中出现滞后条带（shift band），从而指示蛋白质与DNA的结合。通过加入未标记的特异/非特异竞争探针、特异性抗体（supershift）或突变探针，可进一步验证结合的特异性和鉴定结合蛋白的身份。该技术广泛用于转录因子结合位点鉴定、启动子调控元件分析、药物-DNA相互作用等研究。

技术流程概述：

1、探针制备

根据目标DNA序列设计并合成双链寡核苷酸探针，末端标记生物素，经退火形成双链探针。同时制备未标记的特异竞争探针、非特异竞争探针及突变探针。

2、核提取物制备

收集细胞或组织，利用低渗裂解和高效提取缓冲液制备核蛋白提取物，测定蛋白浓度后分装备用。也可使用纯化的重组蛋白。

3、结合反应

将标记探针与核提取物（或纯化蛋白）在结合缓冲液中孵育，形成DNA-蛋白复合物。反应体系中可加入Poly dI-dC等非特异竞争物以降低非特异性结合。

4、竞争与超迁移反应

特异竞争组加入过量未标记特异探针，非特异竞争组加入非特异探针，超迁移组加入针对目标蛋白的特异性抗体，验证结合特异性和蛋白身份。

5、非变性凝胶电泳

将结合反应产物上样于非变性聚丙烯酰胺凝胶，在低温（4°C）条件下电泳，使DNA-蛋白复合物与游离探针分离。

6、检测与分析

生物素标记探针经化学发光检测，观察并分析shift band和supershift band的位置与强度。

结果展示：

1、DNA-EMSA凝胶滞留实验成像图；

2、竞争实验与超迁移实验验证结果。

图1. DNA-EMSA凝胶滞留实验结果示意图

说明：图中展示DNA-EMSA典型实验结果。Lane 1为游离探针，仅见底部快速迁移条带；Lane 2为蛋白+探针组，出现上方滞后条带（shift band），表明DNA-蛋白复合物形成；Lane 3加入特异竞争探针后shift band消失，证实结合具有特异性；Lane 4加入非特异竞争探针后shift band保留，进一步确认特异性；Lane 5加入抗体后出现更高位置的supershift band，鉴定结合蛋白身份；Lane 6使用突变探针无shift band，表明结合依赖于特定DNA序列。

客户提供的材料与信息：

1、目标蛋白信息及推测结合DNA序列，或相应抗体（用于supershift）；

2、细胞样本不低于1×10^7个细胞，或组织样本不低于200 mg；

3、也可提供纯化蛋白（不低于2 μg）进行体外EMSA；

4、建议提供特异/非特异竞争探针序列及突变位点信息；