RNA互作位点鉴定

在RNA与DNA、RNA以及蛋白质的互作研究中，RNA上的互作位点鉴定对于后续研究至关重要。RNA上的互作位点鉴定具体流程如下。

技术流程概述：

1、生物信息学分析RNA上的互作位点

利用生物信息学分别分析RNA上与DNA（详见“如何预测RNA与DNA的互作”）、RNA（详见“如何预测RNA与RNA的互作”/“如何预测lncRNA/sncRNA的靶基因”-“如何预测非编码RNA的靶miRNA”-“如何预测miRNA的靶基因”-“如何预测tsRNA的靶基因”）和蛋白质（“如何预测RNA与蛋白质的互作”）的互作位点。

2、构建突变RNA表达载体、RNA探针或荧光素酶报告基因载体

①针对RNA上与DNA的互作位点，构建互作位点缺失（通过步骤1分析获取互作位点）或截短（通过步骤1分析未能获取互作位点）的RNA表达载体（一般是lncRNA表达载体）或合成互作位点缺失或截短的RNA（一般是lncRNA）；

②针对RNA上与RNA和蛋白质的互作位点，合成生物素/地高辛标记的互作位点缺失（通过步骤1分析获取互作位点）或截短（通过步骤1分析未能获取互作位点）的RNA探针；

③针对miRNA/tsRNA靶RNA上的互作位点，也可以构建包含互作位点突变靶RNA的荧光素酶报告基因载体。

3、检测RNA与DNA、RNA以及蛋白质的互作

①针对RNA上与DNA的互作位点，把互作位点缺失（通过步骤1分析获取互作位点）或截短（通过步骤1分析未能获取互作位点）的RNA表达载体（一般是lncRNA表达载体）或合成互作位点缺失的RNA（一般是lncRNA）与包含靶DNA启动子的荧光素酶报告基因载体共转染细胞，随后检测荧光素酶活性；

②针对RNA上与RNA和蛋白质的互作位点，利用生物素/地高辛标记的互作位点缺失（通过步骤1分析获取互作位点）或截短（通过步骤1分析未能获取互作位点）的RNA探针开展RNA pulldown检测RNA-RNA和RNA-蛋白质互作；

③针对miRNA/tsRNA靶RNA上的互作位点，还可以把包含互作位点突变靶RNA的荧光素酶报告基因载体与miRNA/tsRNA mimic/inhibitor共转染细胞，随后检测荧光素酶活性。

4、确定RNA上的互作位点

通过消失或减弱的荧光素酶活性或者互作信号确定RNA上与DNA、RNA以及蛋白质的互作位点。

技术流程图：

客户提供的材料与信息：

1、靶RNA与互作的DNA、RNA以及蛋白质信息；

2、细胞系信息。