CUT&RUN/CUT&Tag技术服务

      CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）与CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是近年来发展起来的靶向染色质分析技术，用于在全基因组水平上绘制组蛋白修饰、转录因子及染色质相关蛋白的结合位点图谱。CUT&RUN利用Protein A/G-MNase融合蛋白在抗体引导下定点切割目标蛋白附近的DNA，释放的片段经纯化后用于建库测序或进行qPCR检测；CUT&Tag（亦称CUT&Taq）则利用Protein A/G-Tn5转座酶融合蛋白，在切割DNA的同时直接插入测序接头（tagmentation），省去传统建库步骤，流程更简便。两种技术均无需甲醛交联，在完整细胞核内原位进行，具有信噪比高、细胞用量少、测序深度低等优势，已广泛应用于表观遗传调控、转录因子结合图谱、染色质状态分析等领域。

技术流程概述：

1、细胞核制备与固定

收集细胞，利用洋地黄皂苷（Digitonin）透化细胞膜，将细胞核结合于Concanavalin A（ConA）磁珠上，实现固相化操作。CUT&RUN可选轻度甲醛交联以稳定核结构。

2、一抗孵育

加入针对目标蛋白（组蛋白修饰或转录因子）的特异性一抗，4°C过夜孵育，使抗体与染色质上的目标蛋白结合。

3、融合蛋白结合

CUT&RUN：加入Protein A/G-MNase融合蛋白，通过Protein A/G与抗体Fc段结合，将MNase招募至目标位点附近。CUT&Tag：加入预装载测序接头的Protein A/G-Tn5融合蛋白，同样通过抗体引导定位至目标位点。

4、酶激活与DNA切割

CUT&RUN：加入Ca²⁺激活MNase，在目标蛋白附近切割DNA，释放约300–500 bp片段至上清。CUT&Tag：加入Mg²⁺激活Tn5转座酶，同时切割DNA并插入测序接头，一步完成片段化与建库接头添加。

5、DNA提取与建库

CUT&RUN：提取释放的DNA片段，经末端修复、加A、接头连接等传统建库步骤构建测序文库。CUT&Tag：直接通过PCR扩增完成文库构建或特定片段的检测，无需末端修复与接头连接。

6、测序与数据分析

文库经质控后进行Illumina高通量测序，通过比对、峰calling（MACS2/SEACR）、注释等流程获得目标蛋白全基因组结合图谱。

结果展示：

1、CUT&RUN-qPCR产物电泳验证结果；

2、CUT&RUN/CUT&Tag测序数据分析结果（基因组浏览器tracks、热图、峰注释分布等）。

图1. CUT&RUN-qPCR产物电泳示意图

说明：图中展示CUT&RUN-qPCR产物的琼脂糖凝胶电泳验证结果。DL2000 Marker用于片段大小参照；靶基因A/B/C lanes在预期大小处出现清晰目的条带，表明目标蛋白在相应基因组区域富集；IgG对照lane无可见条带，表明抗体特异性良好、无非特异性切割背景；阳性对照与Input lane均出现预期条带，验证实验体系正常。

图2. CUT&RUN/CUT&Tag数据分析示意图

说明：上图展示数据分析流程，从原始测序数据（FASTQ）经质控过滤（FastQC）、序列比对（Bowtie2）、峰calling（MACS2/SEACR）到注释与下游分析（ChIPseeker/IGV）的完整流程。下图展示三类典型结果：A. IGV基因组浏览器信号tracks，直观展示目标蛋白在基因组各区域的富集峰；B. 峰区域信号热图，按样本聚类展示结合模式；C. 峰注释饼图，展示结合位点在基因组各功能区域（启动子、内含子、外显子、基因间区等）的分布比例。

客户提供的材料与信息：

1、目标蛋白信息（组蛋白修饰类型或转录因子名称），或相应抗体（需经ChIP验证）；

2、CUT&RUN：细胞样本不低于1×10^6个细胞（推荐5×10^6个）；

3、CUT&Tag：细胞样本不低于1×10^5个细胞（推荐1×10^6个）；

4、针对CUT&RUN-qPCR，建议提供可能结合的基因组区域信息及引物序列；

5、建议提供阳性对照与IgG阴性对照抗体信息，以辅助结果判读。