RNA-EMSA技术服务信息

      RNA凝胶滞留实验（RNA-EMSA，亦称RNA gel shift）是研究RNA与蛋白质相互作用的经典方法。实验原理为利用标记（生物素或同位素）的RNA探针与细胞提取物或纯化蛋白孵育，形成RNA-蛋白复合物后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。由于RNA-蛋白复合物的分子量大于游离RNA探针，迁移速率降低，在凝胶中出现滞后条带（shift band），从而指示蛋白质与RNA的结合。通过加入未标记的特异/非特异竞争RNA、特异性抗体（supershift）或突变RNA探针，可进一步验证结合的特异性和鉴定结合蛋白的身份。该技术广泛用于RNA结合蛋白（RBP）结合位点鉴定、非编码RNA功能研究、mRNA稳定性调控元件分析等。

技术流程概述：

1、RNA探针制备

根据目标RNA序列体外转录合成RNA探针，末端标记生物素，经纯化后分装备用。同时制备未标记的特异竞争RNA、非特异竞争RNA及突变RNA探针。全程注意RNase-free操作。

2、蛋白提取物制备

收集细胞或组织，在RNase-free条件下利用裂解缓冲液制备细胞总蛋白或核/胞质组分提取物，测定蛋白浓度后分装备用。也可使用纯化的重组RNA结合蛋白。

3、结合反应

将标记RNA探针与蛋白提取物（或纯化蛋白）在含RNase抑制剂的结合缓冲液中孵育，形成RNA-蛋白复合物。反应体系中可加入酵母tRNA或Poly(I:C)等非特异竞争物以降低非特异性结合。

4、竞争与超迁移反应

特异竞争组加入过量未标记特异RNA，非特异竞争组加入非特异RNA，超迁移组加入针对目标RBP的特异性抗体，验证结合特异性和蛋白身份。

5、非变性凝胶电泳

将结合反应产物上样于非变性聚丙烯酰胺凝胶，在低温（4°C）条件下电泳，使RNA-蛋白复合物与游离RNA探针分离。全程维持RNase-free环境。

6、检测与分析

生物素标记探针经化学发光检测，观察并分析shift band和supershift band的位置与强度。

结果展示：

1、RNA-EMSA凝胶滞留实验成像图；

2、竞争实验与超迁移实验验证结果。

图1. RNA-EMSA凝胶滞留实验结果示意图

说明：图中展示RNA-EMSA典型实验结果。Lane 1为游离RNA探针，仅见底部快速迁移条带；Lane 2为蛋白+RNA探针组，出现上方滞后条带（shift band），表明RNA-蛋白复合物形成；Lane 3加入特异竞争RNA后shift band消失，证实结合具有特异性；Lane 4加入非特异竞争RNA后shift band保留，进一步确认特异性；Lane 5加入抗体后出现更高位置的supershift band，鉴定结合蛋白身份；Lane 6使用突变RNA探针无shift band，表明结合依赖于特定RNA序列/结构。

客户提供的材料与信息：

1、目标RNA结合蛋白（RBP）信息及推测结合RNA序列，或相应抗体（用于supershift）；

2、细胞样本不低于1×10^7个细胞，或组织样本不低于200 mg；

3、也可提供纯化蛋白（不低于2 μg）进行体外RNA-EMSA；

4、建议提供特异/非特异竞争RNA序列及突变位点信息；