探究lncRNA XIST通过促进tsRNA-Gln-5-0004成熟抑制FDX1 mRNA乙酰化和结直肠癌细胞铜死亡的分子机制

一、思路设计策略

1 以新型基因为研究切入点。比如miRNA中的tsRNA和lncRNA中的ucRNA（tsRNA研究可查看我司“技术服务”-“tsRNA相关检测”）。

2 探究新型的基因间调控关系。例如研究lncRNA调控miRNA/tsRNA的剪切成熟、lncRNA调控RNA稳定性（可查看我司“技术服务”-“RNA稳定性研究”）以及lncRNA调控基因转录（可查看我司“技术服务”-“RNA与DNA的相互作用”），而不局限于竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)的调控关系。

3 重视RNA修饰在基因间调控的作用。比如RNA甲基化对RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-蛋白互作的影响，或者RNA乙酰化对RNA稳定性的影响（可查看我司“技术服务”-“RNA修饰研究”、“RNA与RNA的相互作用”、“RNA与DNA的相互作用”、“RNA与蛋白的相互作用”）；

4 选择工具酶作为分子轴中游靶基因，增加深度。例如，lncRNA或者miRNA（tsRNA）调控的靶基因可选择调控RNA乙酰化的乙酰转移酶NAT10，然后再进一步探索NAT10调控的靶基因，从而增加思路的深度。

5 探索新的生理过程或功能。比如，研究目的基因对新型程序性死亡铁死亡或铜死亡的调控作用（可查看我司“技术服务”-“细胞死亡相关检测”）。

基于上述策略，下面我们开始进行思路设计。

二、背景

转运RNA（transfer RNA，tRNA）衍生的tsRNA（tRNA-derived small RNA）是一类新型的小非编码RNA(1)。现有研究发现tsRNA有以下几种作用机制：① 以类似microRNA的方式参与RNA干扰；②调控靶基因mRNA的稳定性；③调控靶基因mRNA翻译(1)。通过对已有表达谱数据挖掘，我们发现tsRNA-Gln-5-0004在结直肠癌组织中表达升高（图1），预示着tsRNA-Gln-5-0004可能促进结直肠癌发生和发展。

随后，我们探索结直肠癌中上调tsRNA-Gln-5-0004的分子机制。生物信息学分析发现，lncRNA XIST（X inactivation-specific transcript）与tsRNA-Gln-5-0004结合（图2）。研究表明，lncRNA XIST在结直肠癌组织高表达且促进结直肠癌发生和发展(2)。因此，lncRNA XIST可能在结直肠癌中增强tsRNA-Gln-5-0004表达。和miRNA类似，DICER/DICER1等RNA剪切酶也参与到tsRNA的剪切和成熟（图3）。进一步生物信息学分析表明，在人类癌细胞中lncRNA XIST与DICER/DICER1结合（图4）。此外，有研究发现在卵巢癌中lncRNA DATOC-1结合DICER/DICER1后促进miR-7成熟，从而增加miR-7表达(3)。据此，我们推测，结直肠癌中lncRNA XIST结合DICER/DICER1后促进tsRNA-Gln-5-0004成熟，从而增加tsRNA-Gln-5-0004水平。

接着，我们进一步探索tsRNA-Gln-5-0004调控结直肠癌发生和发展的潜在机制。生物信息学分析表明，乙酰转移酶NAT10（N-acetyltransferase 10）mRNA是tsRNA-Gln-5-0004的靶mRNA（图5）。因此，我们认为结直肠癌中tsRNA-Gln-5-0004可能抑制NAT10表达。

铜死亡（Cuproptosis）是最新发现的由铜离子诱导的程序性细胞死亡，其中FDX1（ferredoxin 1）是重要的铜死亡诱导因子(4)。生物信息学分析表明，FDX1 mRNA上有潜在的乙酰化修饰位点（图6，ac4C）。新近研究发现乙酰化可促进mRNA稳定性，从而增强mRNA水平(5)。据此，我们推测结直肠癌中tsRNA-Gln-5-0004抑制NAT10表达，导致FDX1 mRNA乙酰化和表达下降，从而抑制结直肠癌细胞铜死亡。

此外，我们还发现FDX1 mRNA的乙酰化修饰位点与甲基化修饰位点重合（图6，红色标记）。目前研究表明，RNA甲基化影响RNA的稳定性、定位、运输、剪切和翻译，在癌症等疾病发生中发挥重要作用(6)。另外，有研究表明RNA甲基化可促进lncRNA XIST功能(7)。基于此，我们认为结直肠癌中FDX1 mRNA甲基化可能也会抑制其乙酰化，从而导致FDX1表达下调，进而抑制结直肠癌细胞铜死亡。

图1 tsRNA-Gln-5-0004在结直肠癌组织中的表达

图2 LncRNA XIST与tsRNA-Gln-5-0004结合位点示意图

图3 tsRNA成熟过程示意图

图4 人类癌细胞中lncRNA XIST与DICER/DICER1结合

图5 NAT10 mRNA与tsRNA-Gln-5-0004结合位点示意图

图6 FDX1 mRNA上乙酰化修饰位点和甲基化修饰位点

三、思路

综合以上研究，我们提出以下假说：

1）tsRNA-Gln-5-0004可能促进结直肠癌发生和发展；

2）结直肠癌中lncRNA XIST结合DICER/DICER1后促进tsRNA-Gln-5-0004成熟，从而增加tsRNA-Gln-5-0004水平；

3） 结直肠癌中tsRNA-Gln-5-0004可能抑制NAT10表达；

4）结直肠癌中tsRNA-Gln-5-0004抑制NAT10表达，导致FDX1 mRNA乙酰化和表达下降，从而抑制结直肠癌细胞铜死亡；

5）结直肠癌中FDX1 mRNA甲基化可能也会抑制其乙酰化，从而导致FDX1表达下调，进而抑制结直肠癌细胞铜死亡。

四、实验方案

接着，我们设计以下关键实验来验证上述假说是否成立，然后在此基础上再去设计其他的实验完善细节（下列方案非完整方案，仅列出关键实验内容）：

1 检测结直肠癌细胞中tsRNA-Gln-5-0004的表达

实验材料：HT29细胞，SW480细胞，Caco-2细胞，HCT116细胞，LS174T细胞，HIEC-6细胞

实验方法：qPCR

实验分组：HT29细胞组，SW480细胞组，Caco-2细胞组，HCT116细胞组，LS174T细胞组，HIEC-6细胞组

检测内容：为明确tsRNA-Gln-5-0004在结直肠癌细胞系中的表达是否与结直肠癌组织中一致，我们在结直肠癌细胞系HT29细胞，SW480细胞，Caco-2细胞，HCT116细胞，LS174T细胞中利用qPCR检测tsRNA-Gln-5-0004水平（可查看我司“技术服务”-“tsRNA相关检测”），人正常肠道上皮细胞系HIEC-6细胞作为对照

2 检测tsRNA-Gln-5-0004对结直肠癌细胞的影响

实验材料：HT29细胞，SW480细胞

实验方法：CCK-8，克隆形成，划痕实验，Transwell实验

实验分组：对照组，inhibitor NC组，tsRNA-Gln-5-0004 inhibitor组

检测内容：明确tsRNA-Gln-5-0004在结直肠癌细胞系中的表达后选取两株结直肠癌细胞系进行后续实验；合成inhibitor NC和tsRNA-Gln-5-0004 inhibitor（可查看我司“技术服务”-“tsRNA相关检测”），然后按上述分组处理细胞，接着分别利用CCK-8检测细胞增殖、克隆形成检测细胞克隆能力、划痕实验检测细胞迁移能力以及Transwell实验检测细胞侵袭能力

3 检测tsRNA-Gln-5-0004对结直肠癌细胞铜死亡的影响

实验材料：HT29细胞，SW480细胞

实验方法：比色法，流式，Western Blot（WB）

实验分组：对照组，inhibitor NC组，tsRNA-Gln-5-0004 inhibitor组

检测内容：由于思路设计时涉及到铜死亡，因此我们需明确tsRNA-Gln-5-0004对结直肠癌细胞铜死亡的影响；按上述分组处理细胞，随后分别利用比色法检测细胞中的铜离子含量、比色法检测细胞中谷胱甘肽（GSH）含量、流式和Annexin V检测程序性死亡细胞比例以及WB检测FDX1蛋白水平（可查看我司“技术服务”-“细胞死亡相关检测”）

4 检测tsRNA-Gln-5-0004对结直肠癌细胞体内成瘤的影响

实验材料：HT29细胞，SW480细胞，BALB/c裸鼠

实验方法：皮下成瘤

实验分组：对照组，tsRNA-Gln-5-0004敲除组

检测内容：首先构建敲除tsRNA-Gln-5-0004的结直肠癌细胞株，然后把结直肠癌细胞皮下移植到裸鼠体内后，期间定期检测肿瘤尺寸，待细胞皮下移植21天后裸鼠被安乐死，随后取肿瘤组织称重和拍照

5 明确lncRNA XIST促进tsRNA-Gln-5-0004成熟

实验材料：HT29细胞，SW480细胞

实验方法：qPCR

实验分组：对照组，siRNA NC组，lncRNA XIST siRNA组

检测内容：首先合成并筛选有效的lncRNA XIST siRNA，接着按上述分组处理细胞沉默lncRNA XIST，随后利用qPCR检测tsRNA-Gln-5-0004水平

6 明确lncRNA XIST促进DICER/DICER1结合tRNA-Gln-CTG-1-1

实验材料：HT29细胞，SW480细胞

实验方法：RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation，RIP）

实验分组：对照组，siRNA NC组，lncRNA XIST siRNA组

检测内容：明确lncRNA XIST促进tsRNA-Gln-5-0004成熟后则可进一步研究相应的调控机制；按上述分组处理细胞沉默lncRNA XIST，随后利用DICER/DICER1抗体开展RIP检测DICER/DICER1与tRNA-Gln-CTG-1-1结合，tsRNA-Gln-5-0004源自tRNA-Gln-CTG-1-1（RIP检测可查看我司“技术服务”-“RNA与蛋白质的相互作用”）

7 明确tsRNA-Gln-5-0004与NAT10 mRNA结合

实验材料：HT29细胞，SW480细胞

实验方法：miRNApulldown，qPCR

实验分组：探针组，阴性探针组

检测内容：首先合成tsRNA-Gln-5-0004探针，随后利用探针开展miRNA pulldown，然后利用qPCR检测miRNA pulldown产物中NAT10 mRNA的水平（miRNA pulldown检测可查看我司“技术服务”-“RNA与RNA的相互作用”）

8 明确tsRNA-Gln-5-0004抑制NAT10表达

实验材料：HT29细胞，SW480细胞

实验方法：miRNApulldown，双荧光素酶报告基因系统

实验分组：对照组，inhibitor NC组，tsRNA-Gln-5-0004 inhibitor组

检测内容：首先分别构建含野生型和tsRNA-Gln-5-0004结合位点突变的NAT10 mRNA3‘UTR的荧光素酶报告基因载体，然后按上述分组将空白荧光素酶报告基因载体、野生型NAT10 mRNA3‘UTR或tsRNA-Gln-5-0004结合位点突变的NAT10 mRNA3‘UTR的荧光素酶报告基因载体与inhibitor NC或tsRNA-Gln-5-0004 inhibitor共转染细胞，随后检测细胞的荧光素酶活性

9 明确NAT10促进FDX1 mRNA乙酰化和稳定性

实验材料：HT29细胞，SW480细胞

实验方法：RIP，RNA乙酰化免疫共沉淀（Acetylated RNA immunoprecipitation，acRIP），放线菌素D处理法

实验分组：对照组，空白载体组，NAT10表达载体组

检测内容：首先构建NAT10表达载体；按上述分组处理细胞，随后分别利用RIP检测NAT10与FDX1 mRNA结合、acRIP检测NAT10 mRNA乙酰化水平以及放线菌素D处理法检测FDX1 mRNA稳定性（上述检测可分别查看我司“技术服务”-“RNA与蛋白的相互作用”、“RNA修饰研究”以及“RNA稳定性研究”）

10 检测FDX1 mRNA甲基化水平

实验材料：HT29细胞，SW480细胞，HIEC-6细胞

实验方法：RNA甲基化免疫共沉淀（Methylated RNA immunoprecipitation，MeRIP）

实验分组：HT29细胞组，SW480细胞组，HIEC-6细胞组

检测内容：利用m6A抗体开展MeRIP检测结直肠癌细胞以及正常肠道上皮细胞中FDX1 mRNA甲基化水平（可查看我司“技术服务”-“RNA修饰研究”）

11 明确RNA甲基化对FDX1 mRNA乙酰化和稳定性的影响

实验材料：HT29细胞，SW480细胞

实验方法：RIP，acRIP，放线菌素D处理法

实验分组：对照组，siRNA NC组，METTL3+METTL14 siRNA组

检测内容：METTL3和METTL14是RNA甲基化中的重要甲基转移酶；合成并筛选有效的METTL3和METTL14 siRNA，接着按上述分组处理细胞沉默METTL3和METTL14，然后分别利用RIP检测NAT10与FDX1 mRNA结合、acRIP检测NAT10 mRNA乙酰化水平以及放线菌素D处理法检测FDX1 mRNA稳定性（上述检测可分别查看我司“技术服务”-“RNA与蛋白的相互作用”、“RNA修饰研究”以及“RNA稳定性研究”）

五、参考文献

1.    Liu B, Cao J, Wang X, Guo C, Liu Y, Wang T.Deciphering the tRNA-derived small RNAs: origin, development, and future. CellDeath Dis. 2021;13(1):24.

2.    Yang X, Zhang S, He C, Xue P, Zhang L, He Z, et al. METTL14suppresses proliferation and metastasis of colorectal cancer by down-regulatingoncogenic long non-coding RNA XIST. Mol Cancer. 2020;19(1):46.

3.    Qin W, Miao Y, Sun G, Chen S, Zang YS, Dong C. Long noncoding RNADATOC-1 that associate with DICER promotes development in epithelial ovariancancer by upregulating miR-7 expression. Transl Cancer Res. 2021;10(5):2379-88.

4.    Tsvetkov P, Coy S, Petrova B, Dreishpoon M, Verma A, Abdusamad M,et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins.Science. 2022;375(6586):1254-61.

5.    Arango D, Sturgill D, Alhusaini N, Dillman AA, Sweet TJ, HansonG, et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.Cell. 2018;175(7):1872-86 e24.

6.    Pan Y, Ma P, Liu Y, Li W, Shu Y. Multiple functions of m(6)A RNAmethylation in cancer. J Hematol Oncol. 2018;11(1):48.

7.    Patil DP, Chen CK, Pickering BF, Chow A, Jackson C, Guttman M, etal. m(6)A RNA methylation promotes XIST-mediated transcriptional repression.Nature. 2016;537(7620):369-73.